Novo método dispensa emprego de mamíferos na avaliação da toxicidade de compostos químicos

Plataforma desenvolvida na Unicamp utiliza um pequeno crustáceo, denominado Parhyale hawaiensis, para avaliar se uma determinada substância pode causar dano ao material genético dos espermatozoides e trazer riscos à fertilidade

Ricardo Muniz | Agência FAPESP – Um grupo de pesquisa da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp) validou um teste inovador que dispensa o emprego de mamíferos para a verificação de danos ao DNA. O trabalho foi publicado na revista Science of The Total Environment.

Compostos químicos podem causar danos no material genético de espermatozoides, levando à diminuição da fertilidade e consequente redução de populações. No registro de substâncias químicas, a avaliação desse perigo é realizada por meio de testes de laboratório obrigatórios. Os procedimentos clássicos utilizam mamíferos, mas têm sido substituídos por novas abordagens (NAMs, sigla em inglês para New Approach Methods). Para avaliação de cosméticos, por exemplo, metodologias que usam vertebrados já são proibidas.

O Laboratório de Ecotoxicologia e Genotoxicidade (Laeg) da Faculdade de Tecnologia da Unicamp vem desenvolvendo desde 2010 uma plataforma alternativa para testes de toxicidade utilizando um pequeno organismo do grupo dos invertebrados chamado Parhyale hawaiensis, um anfípode (ordem de pequenos crustáceos) que vive em águas rasas ou regiões entremarés e está distribuído globalmente em regiões tropicais. Quando adulto, mede ao redor de 10 milímetros, tem 23 pares de cromossomos e um genoma 30% maior do que o do ser humano.

Plataforma de testes desenvolvida na Unicamp (foto: Marina Tenório Botelho)

“Ele vem sendo usado como modelo em estudos de evolução e desenvolvimento e foi introduzido por nosso grupo de pesquisa como organismo teste em avaliações de toxicidade”, conta Gisela de Aragão Umbuzeiro, doutora em genética e biologia molecular pela Unicamp e livre-docente em toxicologia pela Universidade de São Paulo (USP), com estágio de pós-doutorado no National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) e na Environmental Protection Agency (EPA) dos Estados Unidos.

“P. hawaiensis tem a vantagem de se desenvolver facilmente em cultivo de laboratório, utilizando pouco espaço e produzindo muitos organismos semanalmente”, complementa Umbuzeiro, que coordena um projeto financiado pela FAPESP.

Os testes desenvolvidos são sempre miniaturizados – para gerar o mínimo de resíduo e utilizar pequenas quantidades de amostra – e diferentes protocolos são capazes de medir morte, reprodução e danos ao material genético das células do “sangue” (chamado hemolinfa) de P. hawaiensis.

Neste trabalho, Marina Tenório Botelho, pós-doutoranda do grupo de Umbuzeiro e bolsista da FAPESP, conseguiu dissecar os machos para remover os testículos e otimizou um método para detectar danos no material genético do espermatozoide dos animais.

O método utilizado é chamado de ensaio cometa: após colocar os espermatozoides numa lâmina de vidro com gel, são feitos tratamentos para que somente o material genético (DNA) das células fique no gel. Nessas lâminas com gel é então aplicada uma corrente elétrica que faz pedaços menores de DNA (que indicam quebras) se moverem mais rapidamente que os grandes pedaços de DNA (intacto e sem lesões), formando o aspecto de um cometa. Depois, é aplicado um corante fluorescente nas lâminas e observa-se o comportamento de migração do material genético no microscópio, com aumento de 400 vezes.

Ensaio cometa (imagem: Marina Tenório Botelho)

No artigo publicado, o teste foi validado com compostos conhecidamente mutagênicos como prova de conceito (etilmetanosulfonato e benzo[a]pireno, entre outros). “Observamos que, quando os machos adultos foram expostos por 24 a 96 horas, foi possível detectar danos no DNA dos espermatozoides de forma crescente em relação à concentração de exposição”, detalha Umbuzeiro.

O teste tem potencial para ser utilizado no futuro como alternativa para avaliação da genotoxicidade em células germinativas, indicando a capacidade de os compostos químicos atingirem os testículos dos organismos e causarem danos ao material genético. Novos estudos estão agora em andamento para estabelecer um protocolo que seja capaz de indicar danos às células dos ovários de organismos expostos.

O artigo Designing and applying a methodology to assess sperm cell viability and DNA damage in a model amphipod pode ser lido em: www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0048969724054688.