Un cóctel enzimático desarrollado en Brasil potencia la producción de etanol de segunda generación

Mediante la aplicación de ingeniería genética, científicos brasileños lograron desarrollar una plataforma de bajo costo para la producción de enzimas que degradan la biomasa de la paja y del bagazo de la caña de azúcar. Las nuevas moléculas pueden tener incontables aplicaciones industriales

Por Maria Fernanda Ziegler  |  Agência FAPESP – Mediante la aplicación de técnicas de ingeniería genética, científicos del Centro Nacional de Investigaciones en Energía y Materiales (CNPEM) de Brasil desarrollaron un hongo con capacidad para producir un cóctel de enzimas que degrada biomasa. A través de este proceso, las enzimas actúan en forma coordinada en la rotura y la conversión de los hidratos de carbono de la paja y del bagazo de la caña de azúcar en azúcares simples, que pueden sufrir fermentación y transformarse entonces en biocombustible. 

Este descubrimiento abre el camino hacia un mayor aprovechamiento de los residuos de la caña de azúcar en la fabricación de biocombustibles, toda vez que el desarrollo de un cóctel de enzimas de bajo costo constituye un de los principales desafíos en la producción del etanol de segunda generación (derivado del bagazo y de la paja de la caña de azúcar).

Para que el hongo pudiese servir como una biofábrica altamente productiva del cóctel enzimático, los investigadores del CNPEM realizaron seis modificaciones genéticas en una cepa conocida del Trichoderma reesei: la cepa RUT-C30. Este trabajo se patentó y fue objeto de un artículo publicado en la revista Biotechnology for Biofuels.

“El hongo fue modificado racionalmente, de manera tal que maximice la producción de las enzimas de interés biotecnológico. Mediante el empleo de la técnica de edición genética conocida como CRISPR/ Cas9, alteramos factores de transcripción a los efectos de regular la expresión de genes relacionados con las enzimas, retiramos proteasas que causaban problemas en la estabilidad del cóctel enzimático y también agregamos enzimas importantes que eran naturalmente deficientes en el hongo. De este modo, fue posible hacer que el hongo produjera una gran cantidad de enzimas con base en una fuente nutricional barata como la de los residuos agroindustriales, abundantes en Brasil”, declaró Mario Murakami, director científico del Laboratorio Nacional de Biorrenovables (LNBR-CNPEM) a Agência FAPESP. 

Según datos de la Compañía Nacional de Abastecimiento (CONAB) del país, con una molienda de caña de azúcar de alrededor de 633 millones de toneladas por zafra, Brasil genera unos 70 millones de toneladas de masa seca de paja. Sin embargo, poco de esos residuos se aprovechan para la producción de etanol.

Murakami remarca que prácticamente todas las enzimas utilizadas en Brasil para la degradación de biomasa se importan, provenientes de un grupo restricto de empresas extranjeras que poseen esa tecnología en carácter industrial. Con ese contexto, el cóctel enzimático importado puede representar hasta el 50% del costo de producción del combustible. 

“Existía un paradigma que indicaba que el desarrollo de una plataforma competitiva de producción de cóctel enzimático podría llevar décadas de estudios, y que sería poco probable obtenérsela únicamente mediante técnicas de biología sintética, con base en cepas públicas. Sucede que las empresas utilizaron distintos métodos para desarrollar los cócteles, tales como los de concretar evoluciones adaptativas, exponer al hongo a reactivos químicos e inducir mutaciones en el genoma, para luego seleccionar el fenotipo más interesante. Pero con la evolución de las herramientas de edición genética, como la CRISPR/ Cas9, logramos afianzar en dos años y medio una plataforma competitiva con unas pocas modificaciones racionales”, declara Murakami a Agência FAPESP. 

Con base en el bioproceso desarrollado en el CNPEM, se produjeron 80 g/ L de enzimas, la mayor concentración descrita hasta ahora en una publicación científica a partir de fuentes de carbono (azúcar) de bajo costo. Dicho valor duplica con creces la más alta concentración de enzimas hasta ahora informada en la literatura científica para este tipo de hongos (37 g/ L de enzimas). 

“Un aspecto interesante de este trabajo reside en que no se ciñó únicamente al laboratorio. Pusimos a prueba la producción y el bioproceso de escalonamiento en una planta piloto, en un ambiente semiindustrial, para la evaluación de la factibilidad económica”, dice. 

De acuerdo con Murakami, al margen de la plataforma fúngica fue personalizada para la producción de etanol celulósico con base en los residuos de la caña de azúcar, también es capaz de deconstruir otras biomasas, y esos azúcares denominados avanzados podrían utilizarse para la elaboración de otros productos biorrenovables, tales como plásticos e intermediarios químicos.

Un nuevo tipo de enzimas

Este trabajo es el resultado práctico en aplicaciones industriales de una amplia investigación realizada por el LNBR con la mira puesta en el descubrimiento de enzimas capaces de degradar hidratos de carbono. En otro estudio, apoyado por la FAPESP y publicado en la revista Nature Chemical Biology, los investigadores revelaron siete nuevos tipos de enzimas presentes fundamentalmente en hongos y bacterias. 

De acuerdo con Murakami, el descubrimiento de las nuevas enzimas posee un gran potencial de aplicación, no solamente en el área de biocombustibles sino también en distintas áreas de la industria médica, alimenticia y textil, por ejemplo. Sucede que esas moléculas pueden servir de inspiración para la elaboración de nuevos procesos industriales, pues muestran diferentes maneras por las cuales la naturaleza descompone polisacáridos (hidratos de carbono formados por azúcares simples).

De esta forma, por ser capaces de degradar polisacáridos β-glucanos, la nueva familia de enzimas del tipo hidrólisis glucosídicas (GH) posee un amplio potencial de utilización, al poder actuar como conservantes alimenticios −por su acción antifúngica que rompe la barrera que protege a esos microorganismos–, o también en la industria textil o de biocombustibles, por su capacidad de digestión de materias ricas en fibras vegetales. 

“Realizamos un estudio basado en la diversidad de la naturaleza para degradar polisacáridos y en la posibilidad de proyectar la aplicación de ese conocimiento en distintos sectores de la industria. Aparte del descubrimiento de nuevas enzimas en sí mismas, otro aspecto importante de este trabajo reside en el abordaje que utilizamos para conocer sistemáticamente y a fondo a esta nueva familia de enzimas a partir de redes de similitud. Así fue como logramos en poco tiempo, y partiendo de cero, llegar a la familia de enzimas activas sobre β-1,3-glucanos más estudiadas que tenemos hasta ahora, con información disponible sobre especificidad y mecanismos de acción”, dice Murakami en declaraciones a Agência FAPESP.

Sucede que en los estudios de clasificación de nuevas enzimas generalmente el criterio evolutivo de las moléculas (análisis filogenético) constituye el abordaje principal. Pero en el trabajo del CNPEM el punto de partida fue la funcionalidad de las enzimas. 

“Hoy en día, con la evolución tecnológica de la secuenciación de ADN, contamos con una gran cantidad de secuencias genéticas conocidas, aparte de tener una capacidad afianzada para estudiar y caracterizar moléculas y enzimas con base en sus funcionalidades. De este modo, perfeccionamos un abordaje denominado de redes de similitud que nunca se había utilizado en enzimas activas sobre polisacáridos”, dice. 

El abordaje de redes de similitud permitió clasificar a las enzimas según su funcionalidad y generar siete subfamilias. De este modo, mediante la caracterización de al menos un miembro representativo de cada subfamilia, fue posible acceder sistemáticamente a la diversidad de estrategias moleculares para la degradación de polisacáridos β-glucanos contenida en miles de miembros de la familia de enzimas.

Un tour de force bioquímico

Mientras que en el análisis filogenético la comparación se basa en las áreas conservadas de la secuencia de ADN –lo que no se alteró en el transcurso del tiempo– la clasificación por funcionalidad transcurre mediante el análisis de áreas no conservadas y relacionadas con la diferenciación funcional. “Esto nos aportó eficiencia y nos permitió agrupar más de mil secuencias en tan solo siete subgrupos o tipos de igual función”, dice. 

Por tratarse de un nuevo abordaje, los investigadores realizaron otros estudios que hicieron las veces de contraprueba para la validación de este método de clasificación. 

De los siete grupos de enzimas capaces de degradar polisacáridos, los científicos obtuvieron 24 estructuras inéditas que incluían diversos complejos de las enzimas con sus sustratos, información clave para la comprensión de los mecanismos de acción. 

Este trabajo contó con una parte de análisis funcional y otra de estudio estructural de las moléculas, a los efectos de poder entender de qué manera actúa la enzima en ese hidrato de carbono. “Los polisacáridos pueden adoptar decenas de configuraciones y concretar diversos tipos de uniones químicas. Pretendíamos observar exactamente qué uniones químicas y cuáles arquitecturas conocían cada enzima. Por ende, fue necesario llevar a cabo un estudio multidisciplinario, para combinar datos estructurales y funcionales basados en análisis mediante espectrometría de masas, espectroscopía, mutagénesis y experimentos de difracción para dilucidar la estructura atómica”, dice.  

En un texto de la sección News & Views, publicado en la revista Nature Chemical Biology, Paul Walton, investigador del departamento de química de la Universidad de York (EE.UU.), consideró que este estudio constituye un “tour de force bioquímico” no solamente por su abordaje innovadoro, sino también por la rapidez con que se obtuvieron los resultados. “El grupo de investigadores fue capaz de expresar y aislar ejemplos de cada tipo de enzimas para analizar si las diferencias en las secuencias genéticas de cada tipo se reflejaban en forma estructural y en funcionalidad”, sostiene Walton en el comentario.

El artículo intitulado Rational engineering of the Trichoderma reesei RUT-C30 strain into an industrially relevant platform for cellulase production (doi: doi.org/10.1186/s13068-020-01732-w), de Lucas Miranda Fonseca, Lucas Salera Parreiras y Mario Tyago Murakami, puede leerse ingresando en el siguiente vínculo: biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-020-01732-w.
 
Y puede leerse el artículo intitulado Structural insights into β-1,3-glucan cleavage by a glycoside hydrolase family (doi: doi.org/1 0.1038/s41589-020-0554-5), de Camila R. Santos, Pedro A. C. R. Costa, Plínio S. Vieira, Sinkler E. T. Gonzalez, Thamy L. R. Correa, Evandro A. Lima, Fernanda Mandelli, Renan A. S. Pirolla, Mariane N. Domingues, Lucelia Cabral, Marcele P. Martins, Rosa L. Cordeiro, Atílio T. Junior, Beatriz P. Souza, Érica T. Prates, Fabio C. Gozzo, Gabriela F. Persinoti, Munir S. Skaf y Mario T. Murakami, en el siguiente enlace: www.nature.com/articles/s41589-020-0554-5.